透過 dokdo 製作 LEfSe 輸入資料

在已經裝好 dokdo 的 QIIME2 環境下輸入，
不需要跑很久，通常一兩分鐘內會完成 :

dokdo prepare-lefse \
    -t table-dada2.qza \
    -x taxonomy.qza \
    -m sample-metadata.tsv \
    -o input_table.tsv \
    -c Sex

#若不在目前所在資料夾，記得加入相對路徑or絕對路徑告知檔案位置。

dokdo prepare-lefse : 使用 dokdo 套件中 prepare-lefse 函式
-t / -x / -m 分別為需要的資料。
-o 則是產出的檔案名稱。
-c 是填入想要分析的組別，務必與sample-metadata所描述的組別名稱完全相同。
本篇教學為最基礎的 LEfse操作，省略了 subclass subject 複賽參數的設定，
如果想要加入可以參考官方文件。

可能出現的報錯情況 :

raise KeyError(key) from err
KeyError: 'group'

代表組別名稱輸入錯誤，可以藉由查看 sample-metadata 確認組別名稱:

vim sample-meatadata.tsv

完成後不會顯示任何成功訊息，
可以查看輸出的資料夾有沒有對應的檔案名稱
input-table.tsv。

Galaxy with LEfSe 網頁版

秉持能少一事就少一事的精神(?)，
這邊使用 Galaxy 網頁內含的 LEfSe 線上分析功能 :

1. 點上傳按鈕 :
   

2. 上傳input-table.tsv檔案，記得在右下角按Start
   

3. 看到舒服的綠燈就可以按右下角 Close
   

4. 點左側LEfSe > A) Format Data for LEfSe
   

5. 會顯示剛剛的檔案，若紅框處沒有出現剛剛上傳的檔案名稱，可以再點擊LEfSe > A) Format Data for LEfSe 或重整頁面。在這邊會有一些參數的調整，教學方便都以預設值不變動，之後長大(萬一不小心簽博了)想做點進階分析就可以調整 SubClass 與 Subject。
   

6. 無懸念地點下Execute，出現綠色視窗請給自己一個掌聲! 並點 B) LDA Effect Size (LEfSe) 進行排名分析。
   

7. 這邊可以設定包含各步驟統計分析的 p value (熟悉的0.05)以及 LDA score Log 值(default 2)，如果發現預設跑不出顯差Q，可以考慮在 Set the strategy for muti-class analysis 選項中選擇One-against-all(less strict) : )
   

8. 同樣會出現綠色視窗，請繼續為自己歡呼，點 C) Plot LEfSe Results，要產圖囉! 在此是 LDA 的橫向柱狀圖，這邊有多種解析度 dpi /字型等參數可以調整，因為下一篇有調整顏色的教學，因此這邊格式選擇 svg。
   

9. D) Plot Cladogram 則是可以產出的經典 LEfSe 同心圓，同樣可以做基本的產圖調整，一樣先選擇 svg。
   

10. 注意到右側有曾經上傳的檔案以及產出的檔案，
    可以在想要下載的檔案點檔案名稱就會跑出可以儲存的圖案

11. 點開後就可以用瀏覽器查看圖片了~ (這邊先放 LDA 示意，同心圓就交給讀者點開了)
    

到此就獲得 LEfSe 的結果，如果發現錯誤訊息關於無顯著差異也不要難過，
分析沒有結果也是一種結果，
而若有幸運產出圖則可以開始試著查看顯著差異的菌種資訊與文獻，
說不定有意想不到與你研究有關連結。

其實 LEfSe 有提供 CLI 指令式操作，但筆者本機疑似相容性與版本衝突問題，
暫時沒有解決，改以網頁版工具呈現，效果相同。

下回會介紹顏色的調配 !

典型的 LEfSe 即是你所看到的上述模樣，身為點了一些前端網頁工程技能的筆者，看到這該死的配色實在是有點美感焦慮，於是我們來動動手腳，讓研究結果的呈現更有美感~